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產(chǎn)品簡介：

雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒(Dual Luciferase Reporter Gene Assay Kit)，是先以螢光素(luciferin)為底物來檢測螢火蟲螢光素酶(Firefly luciferase)，后以腸腔素(coelenterazine)為底物來檢測海腎螢光素酶(Renilla luciferase)，并且在后續(xù)加入海腎螢光素酶底物時，同時加入抑制螢火蟲熒光素酶催化luciferin發(fā)光的物質(zhì)，使后續(xù)檢測僅僅檢測到海腎螢光素酶的活性，實(shí)現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。

螢火蟲螢光素酶是一種分子量約為61kD的蛋白，在ATP、鎂離子和氧氣存在的條件下，可以催化luciferin氧化成oxyluciferin，在luciferin氧化的過程中，會發(fā)出生物螢光(bioluminescence)。海腎螢光素酶是一種分子量約為36kD的蛋白，在氧氣存在的條件下，可以催化coelenterazine氧化成coelenteramide，在coelenterazine氧化的過程中也會發(fā)出生物螢光。生物螢光可以通過化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或液閃測定儀進(jìn)行測定。本試劑盒的檢測原理參考圖1.

雙螢光素酶報告基因檢測試劑盒為檢測基因的表達(dá)量提供有效的手段，在DLR 檢測中，螢火蟲螢光素酶（Firefly luciferase）和海腎螢光素酶（Renilla luciferase）的活性可在單個樣品中依次檢測。先以螢光素（Luciferin）為底物來檢測螢火蟲螢光素酶的活性，然后加入抑制螢火蟲螢光素酶催化的物質(zhì)，同時加入腔腸素（Coelenterazine）檢測海腎螢光素酶的活性，實(shí)現(xiàn)雙螢光素酶報告基因檢測。通過螢光素酶和其底物這一生物發(fā)光體系，可以非常靈敏、高效地檢測基因的表達(dá)。通常把感興趣基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件或 5' 啟動子區(qū)克隆在Luciferase 的上游，或把3'-UTR 區(qū)克隆在Luciferase 的下游，構(gòu)建成報告基因（Reporter gene）質(zhì)粒，然后轉(zhuǎn)染細(xì)胞，用適當(dāng)藥物等處理細(xì)胞后裂解細(xì)胞，通過檢測螢光素酶活性的高低來判斷藥物處理等對目的基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用。海腎螢光素酶更多地被用作檢測轉(zhuǎn)染效率的內(nèi)參，以消除細(xì)胞數(shù)量和轉(zhuǎn)染效率的差異。

螢火蟲螢光素酶催化luciferin發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長為560nm。海腎螢光素酶催化coelenterazine發(fā)光的最強(qiáng)發(fā)光波長為465nm。

本試劑盒的光信號可以通過化學(xué)發(fā)光儀、酶標(biāo)儀或液閃測定儀進(jìn)行測定。該試劑盒具有檢測迅速、靈敏度高、檢測范圍廣，無細(xì)胞內(nèi)源活性干擾等特點(diǎn)。

Figure 1. Bioluminescent reactions catalyzed by firefly luciferase  and Renilla luciferase.

試劑盒組份：

保存條件：

最好在-80℃保存。將 C 組分溶解到 B 組分后，該混合液不可反復(fù)凍融，建議進(jìn)行小批量分裝，并于-20℃(最長可儲存 1 個月)或-80℃（最長可儲存 1 年）條件下儲存。Renilla Luciferase Assay solution（D+E）應(yīng)新鮮配制，當(dāng)天使用。

使用方法：

1. 裂解細(xì)胞：

將報告基因細(xì)胞裂解液充分混勻后，按如下方式加入報告基因細(xì)胞裂解液，充分裂解細(xì)胞。

1.1)對于貼壁細(xì)胞：吸盡細(xì)胞培養(yǎng)液后，參考下表加入適量的報告基因細(xì)胞裂解液；對于懸浮細(xì)胞：離心去上清后，參考下表加入適量報告基因細(xì)胞裂解液。

注：裂解產(chǎn)物可室溫保存 6 h，-70℃可長期存放(裂解產(chǎn)物不能反復(fù)凍融);

注：如果螢光素酶的表達(dá)水平比較低，可以嘗試使用更少的裂解液，例如6孔板的每孔用量可以最小為100微升。
      1.2) 充分裂解后，10,000-15,000g離心3-5分鐘，取上清用于測定。
注：細(xì)胞裂解后可以立即測定螢光素酶，也可以先凍存，待以后再測定。凍存樣品需融解，并達(dá)到室溫后再進(jìn)行測定。

2. Preparation of Firefly Working Solution

2.1) 將所有組分恢復(fù)至室溫。

2.2) 配置10 mg/mL D-luciferin儲存液。2mg組份C溶解在200uL超純水中。儲存液-20℃可以儲存6個月反復(fù)凍融5次。

2.3）工作液配置 ：用組分 B 按照1:50稀釋以上D-luciferin儲存液，配制成 0.2 mg/mL 的螢火蟲螢光素酶工作液。

注：螢火蟲螢光素酶工作液不能反復(fù)凍融超過5次，若單次實(shí)驗(yàn)用量較少，建議按單次使用量分裝成小規(guī)格。

3. Preparation of Renilla Working Solution

3.1)  將所有組分恢復(fù)至室溫。

3.2) 配置2 mg/mL Coelenterazine儲存液。400ug組份C溶解在200uL超純水中。儲存液-20℃可以儲存3個月反復(fù)凍融5次。

3.3）工作液配置 ：用組分 D 按照1:50稀釋以上coelenterazine儲存液，配制成 0.04 mg/mL 的1x coelenterazine工作液。

注：1×Coelenterazine工作液現(xiàn)配現(xiàn)用，配置后在3小時內(nèi)使用。

4. 化學(xué)發(fā)光值檢測

4.1）按儀器操作說明書開啟具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的儀器如酶標(biāo)儀。

4.2）每個樣品測定時，取樣品 20-100uL(如果樣品量足夠，請加入 100 μL；如果樣品量不足可適當(dāng)減少用量，但檢測孔用量需保持一致）。1× Lysis Buffer 為空白對照。

4.3）加入 100uL螢火蟲螢光素酶檢測液，用槍吹打均勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測定 RLU（relative light unit）值。

注：由于該發(fā)光為瞬時發(fā)光，建議加入螢火蟲螢光素酶工作液后，立即進(jìn)行檢測。

4.4）加入 100uL 1× Coelenterazine 工作液，用槍吹打均勻或用其它適當(dāng)方式混勻后測定 RLU（relative light unit）值。

4.5）在以海腎螢光素酶為內(nèi)參的情況下，用螢火蟲螢光素酶測定得到的 RLU 值除以海腎螢光素酶測定得到的 RLU 值。根據(jù)得到的比值來比較不同樣品間目的報告基因的激活程度。如果以螢火蟲螢光素酶為內(nèi)參，也可以進(jìn)行類似計算。

注意事項(xiàng):

1)為取得最佳測定效果，在用單管的化學(xué)發(fā)光儀測定時， 樣品和測定試劑混合后到測定前的時間應(yīng)盡量控制一致；使用具有化學(xué)發(fā)光測定功能的多功能熒光酶標(biāo)儀時，宜先把樣品全部加好，然后統(tǒng)一加入螢火蟲螢光素酶檢測試劑。

2) 由于溫度對酶反應(yīng)有影響，所以測定時，樣品和試劑均需達(dá)到室溫后再進(jìn)行測定。

3 本公司所有產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員用于生命科學(xué)研究，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅。

4) 本公司所有產(chǎn)品必須由合格專業(yè)技術(shù)人員操作同時佩戴口罩/手套/實(shí)驗(yàn)服并遵守生物實(shí)驗(yàn)室安全操作規(guī)程！