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ClearSee™ 是一款植物透明化試劑，僅需固定、洗凈、透明化3步操作即可輕松實(shí)現(xiàn)植物組織的透明化。本方法由名古屋大學(xué)研究生院的栗原大輔博士等人開(kāi)發(fā)。
作為植物科學(xué)的研究工具，ClearSee™ 有望用于闡明細(xì)胞水平的現(xiàn)象與生物個(gè)體之間的系統(tǒng)聯(lián)系。
<資料提供>
名古屋大學(xué)研究生院 理學(xué)研究科
特聘助教栗原大輔、先驅(qū)研究員水多陽(yáng)子
◆特點(diǎn)
● 植物用透明化試劑
● 無(wú)需制備切片，即可熒光觀察植物內(nèi)部的整體結(jié)構(gòu)
● 操作僅需3步：①固定、②清洗、③透明化
◆可透明化的組織
植物
◆透明化所需時(shí)間
根莖：1~2日、葉和幼苗：4~7日、雌蕊：2周、成熟組織：4周
※ 上述時(shí)間僅供參考。透明化所需的時(shí)間因植物種類(lèi)以及組織不同有所差異。
◆透明化所需的試劑
▼試劑
1. ClearSee™
2. 純凈水
3. 多聚甲醛 (產(chǎn)品編號(hào)：160-16061)
4. 2 mol/L 氫氧化鈉溶液（產(chǎn)品編號(hào)：194-05361)
5. 10 x PBS (產(chǎn)品編號(hào)：163-25265)
6. 1 x PBS (產(chǎn)品編號(hào)：164-25511)
7. 亞硫酸鈉（產(chǎn)品編號(hào)：198-03412） ※僅在使用ClearSeeAlpha時(shí)需要使用
▼儀器
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1. 高壓滅菌鍋 2. 局部排氣設(shè)備（如通風(fēng)室） 3. 真空泵 4. 干燥器 5. 60℃恒溫器 6. 錐形管 7. 微管 |
8. 封口膜 9. 針 10. 鑷子 11. 蓋玻片 12. 載玻片 13. 凡士林 14. ClearSee™透明化標(biāo)本用熒光顯微鏡※和推薦物鏡※※ |
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※共焦顯微鏡、雙光子顯微鏡 ※※請(qǐng)準(zhǔn)備適配折射率 (RI=1.41)的物鏡，建議在獲取數(shù)據(jù)之前咨詢(xún)顯微鏡制造商。 |
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ClearSeeAlpha是什么？
ClearAlpha是改良版的ClearSee™，改良方法為向ClearSee™中加入亞硫酸鈉至50mM。使用常規(guī)款ClearSee™進(jìn)行透明化時(shí)，部分種類(lèi)植物的葉和果實(shí)會(huì)因氧化而變成褐色，導(dǎo)致難以觀察，而亞硫酸鈉的還原作用可以實(shí)現(xiàn)清晰的觀察。
請(qǐng)根據(jù)需求制備ClearSeeAlpha，即配即用。
◆Protocol
Protocol（視頻）
請(qǐng)查看以下文獻(xiàn)：
Kurihara, D. et al., : J. Vis. Exp., e63428, 179(2022).
doi:10.3791/63428
◆應(yīng)用示例
擬南芥（葉/根）的觀察示例
圖1. 透明化的擬南芥葉
明亮視野中組織呈透明狀，葉綠素的紅色自發(fā)熒光消失。由于可以觀察完整的葉片，因此也可以觀察到內(nèi)部維管束中的熒光蛋白。
圖2. 使用ClearSee™處理4日的擬南芥根1）
生長(zhǎng)素應(yīng)答細(xì)胞的細(xì)胞核用綠色顯示，全身細(xì)胞的細(xì)胞核用紫色顯示。
*由Kurihara, D. et al., : Development, 142(3), 4168-4179 (2015)改編并轉(zhuǎn)載。
雌蕊的熒光觀察示例
圖3. 觀察完整透明化后的雌蕊2）
花粉管上使用4種熒光蛋白（藍(lán)色、綠色、黃色和紅色）分別進(jìn)行標(biāo)記。
*由Kurihara, D. et al., : Development, 142(3), 4168-4179 (2015)改編并轉(zhuǎn)載。
其他植物
圖4. 透明化的植物葉片
使用ClearSee™處理6天的藍(lán)豬耳、矮牽牛、煙草、番茄、黃瓜、水稻※的葉片。
※ 對(duì)水稻進(jìn)行透明化處理時(shí)，由于水稻葉片表面存在蠟質(zhì)層，溶液難以滲透到組織中。因此在固定操作之前，請(qǐng)將葉片浸泡在氯仿等有機(jī)溶劑中10~30 s，以去除蠟質(zhì)。
子房和角果的觀察示例
圖5. 左：ClearSee™、中：ClearSee改良方法（＋50mM 2-氨基乙硫醇鹽酸鹽）、右：ClearSeeAlpha（＋50mM 亞硫酸鈉
通過(guò)向ClearSee™中加入50 mM亞硫酸鈉（即“ClearSeeAlpha”法），可抑制氧化導(dǎo)致的褐色色素沉著。
*由Kurihara, D. et al., : Plant Cell Physiol., 62(8), 1302-1310 (2021)改變并轉(zhuǎn)載
擬南芥（種子）的觀察示例
對(duì)授粉5天后的擬南芥種子進(jìn)行透明化處理，并用香草醛染色單寧。
使用ClearSeeAlpha法的種子在15天后可確認(rèn)到氧化單寧的去除效果，可對(duì)透明化的種子進(jìn)行觀察。