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替代PCR，RPA成為致病菌檢測(cè)的得力工具

      在今年發(fā)表的一系列文章中，RPA技術(shù)被廣泛用于結(jié)核桿菌、耐藥菌MRSA、沙門(mén)氏菌等常見(jiàn)致病菌的檢測(cè)。在臨床診斷和食品安全方面，為人們提供了簡(jiǎn)單快速的實(shí)地篩查方案。

RPA在臨床診斷領(lǐng)域的應(yīng)用
      艱難梭狀芽孢桿菌（C.difficile）是一種會(huì)引起感染性腹瀉的重要致病菌。日前，研究人員以這種致病菌的毒力基因tcdB為靶標(biāo)，開(kāi)發(fā)了一個(gè)低成本的微流體RPA平臺(tái)，文章發(fā)表在十月二十三日的《Analyst》雜志上。這個(gè)檢測(cè)C.difficile的RPA分析芯片只需要6.4μL的初始樣本，能夠?qū)U(kuò)增反應(yīng)進(jìn)行實(shí)時(shí)監(jiān)控。

      據(jù)估計(jì)，世界上約三分之一的人體內(nèi)潛伏著結(jié)核病（TB）的致病菌，這些致病菌大多在肺部處于休眠狀態(tài)。改善檢測(cè)方法幫助TB診斷，被WHO列為公共建康的首要問(wèn)題之一。RPA作為一種常溫的快速DNA 擴(kuò)增法，為資源匱乏的地區(qū)提供了檢測(cè)TB的簡(jiǎn)便工具。研究人員在RPA的基礎(chǔ)上，快速檢測(cè)了結(jié)核分枝桿菌復(fù)合群MTC的DNA（IS6110和IS1081）。在39°C的環(huán)境下，RPA檢測(cè)能在20分鐘內(nèi)得出高靈敏度的結(jié)果。進(jìn)一步研究表明，在檢測(cè)TB感染者的肺部樣本時(shí)，RPA檢測(cè)比熒光顯微鏡檢測(cè)還要準(zhǔn)確。

      抗生素濫用現(xiàn)象使耐藥菌日漸增多，目前這已經(jīng)成為了一個(gè)全球性的公共健康問(wèn)題。作為一種重要且危險(xiǎn)的致病菌，耐甲氧西林金黃色葡萄球菌MRSA一直是臨床治療中的棘手問(wèn)題。在對(duì)MRSA進(jìn)行DNA檢測(cè)的時(shí)候，引物只能靶標(biāo)一個(gè)多變的染色體區(qū)域，SCCmec。今年七月的《Plos one》雜志上發(fā)表的一項(xiàng)研究，通過(guò)多重RPA反應(yīng)篩查了726個(gè)MRSA分離物。研究人員通過(guò)二代測(cè)序發(fā)現(xiàn)，24個(gè)RPA未檢出的分離物中出現(xiàn)了新的插入突變，需要重新設(shè)計(jì)擴(kuò)增引物。這一結(jié)果說(shuō)明，臨床上的MRSA篩查不能完全依賴(lài)DNA檢測(cè)。

     《Microchimica Acta》雜志今年二月的一項(xiàng)研究，展示了能夠同時(shí)擴(kuò)增和檢測(cè)三種病原體的RPA芯片，包括淋病奈瑟氏菌（Neisseria gonorrhoeae）、沙門(mén)氏菌（Salmonella enterica）和MRSA。這種芯片可以在二十分鐘以?xún)?nèi)完成三種病原體和對(duì)照質(zhì)粒的檢測(cè)，S.enterica和MRSA的檢出限可達(dá)10CFU，N.gonorrhoeae的檢出限可達(dá)100CFU。這項(xiàng)研究中的RPA芯片，有望成為實(shí)地篩查重要致病菌的簡(jiǎn)便工具。

RPA在食品安全領(lǐng)域的應(yīng)用

      產(chǎn)志賀毒素的大腸埃希菌STEC是世界范圍內(nèi)最嚴(yán)重的一種食源性致病菌?！禙OODBORNE PATHOGENS AND DISEASE》雜志今年七月發(fā)表的一項(xiàng)研究，在RPA的基礎(chǔ)上首次建立了等溫實(shí)時(shí)的STEC檢測(cè)體系。研究人員設(shè)計(jì)并評(píng)估了一系列引物和熒光探針，實(shí)現(xiàn)了很高的特異性和靈敏度。

      沙門(mén)氏菌是一種主要的食源性致病菌?！禔nalytical Chemistry》雜志今年三月份發(fā)表的一項(xiàng)研究，將TwistFlow®沙門(mén)氏檢測(cè)整合到微流體裝置中，構(gòu)建了檢測(cè)沙門(mén)氏菌DNA的一體化分析系統(tǒng)。這一微流體裝置整合了致病菌檢測(cè)的三個(gè)主要步驟（DNA提取、RPA擴(kuò)增和結(jié)果檢測(cè)），能夠在三十分鐘內(nèi)以全自動(dòng)的方式完成檢測(cè)。人們可以直接通過(guò)側(cè)流層析試紙條看到沙門(mén)氏菌檢測(cè)的結(jié)果。研究顯示，這種裝置。對(duì)PBS和牛奶的檢測(cè)下限分別為10CFU/ml和100CFU/ml。

       PCR-ELISA已經(jīng)是一個(gè)用途相當(dāng)廣泛的成熟技術(shù)?！禔nalytica Chimica Acta》雜志今年二月發(fā)表的一項(xiàng)研究，首次用RPA取代了PCR，將快速的常溫?cái)U(kuò)增、生物素/鏈霉親和素體系、和比色法免疫分析結(jié)合起來(lái)。這種RPA-ELISA分析法可以用來(lái)篩查食品中的安全隱患，比如過(guò)敏原（榛子、花生、大豆、蕃茄和玉米）、轉(zhuǎn)基因成分（P35S和TNOS）、致病菌（Salmonella sp.和Cronobacter sp.）以及真菌（Fusarium sp.）。這項(xiàng)研究顯示，RPA-ELISA在上述應(yīng)用中均得到了令人滿(mǎn)意的結(jié)果，有著很高的靈敏度和可重復(fù)性。

文章來(lái)源：http://www.biodiscover.com/news/research/115723.html

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