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1. 引物/探針設(shè)計一般原則

RPA擴增片段大小：最佳擴增片段120-150bp，首次篩選建議設(shè)計上下游引物各4條，共16種組合。

引物設(shè)計建議方法：RPA核酸擴增技術(shù)對引物設(shè)計的要求與常規(guī)PCR引物設(shè)計有一定的區(qū)別。由兩條寡核苷酸組成一對引物，分別特異性識別一個核酸目標物的上下游核苷酸序列；引物長度在28-32 nt之間，序列中無回文序列、連續(xù)單堿基重復序列和內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)區(qū)；引物Tm值、GC含量不作為設(shè)計時主要考慮因素；最佳引物對需通過試驗優(yōu)化篩選得到，要求其擴增產(chǎn)物為單一條帶，無非特異性擴增和明顯的引物二聚體。

探針設(shè)計建議方法：探針序列長度在43-50nt之間，序列避免回文序列、內(nèi)部二級結(jié)構(gòu)和連續(xù)的重復堿基；共有四個修飾位點，距離5’端的≥25nt的中部位置標記一個dSpacer（四氫呋喃，THF）作為核酸外切酶的識別位點；THF位點的上游標記一個熒光基團，下游標記一個淬滅基團，兩個基團的間距為2-4 nt，THF 距離3’末端≥14nt；3’末端標記一個修飾基團，例如胺基、磷酸基團、生物素、生物素-TEG 或C3-spacer。

建議用DNAMAN等軟件查看探針和引物的二級結(jié)構(gòu)。

2. 引物探針設(shè)計示范

待擴增的目的片段：（注：雙下劃線標示的上下游引物區(qū)域GCACGAGGAAGCGGTCA和ATGGGTCACGACGAGATCCT來自參考文獻）

TGATGGCAGGTTGGGCGTCGCTTGGTCGGTCATTTCGAACCCCAGAGTCCCGCTCAGAAGAACTCGTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAGCCCATTCGCCGCCAAGCTCTTCAGCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACACCCAGCCGGCCACAGTCGATGAATCCAGAAAAGCGGCCATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCGCGCCTTGAGCCTGGCGAACAGTTCGGCTGGCGCGAGCCCCTGATGCTCTTCGTCCAGATCATCCTGATCGACAAGACCGGCTTCCATCCGAGTACGTGCTCGCTCGATGCGATGTTTCGCTTGGTGGTCGAATGGGCAG

2.1 探針：首先確定探針的位置

GCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCCTGATAGCGGTCCGCCACAC

探針修飾：GCAATATCACGGGTAGCCAACGCTATGTCC [FAM-dT]G[THF][BHQ-dT] AGCGGTCCGCCACAC-C3 Spacer

說明：在T*T、T**T的T上標記FAM和淬滅基團，把兩個T之間的一個堿基換成四氫呋喃THF，探針和擴增片段配對后，四氫呋喃處形成凸起，作為酶識別位點，在此處將探針切斷，從而發(fā)出熒光。

探針有3個修飾位點：dSpacerInt 6-FAM-dT，Int BHQ1 dT，3' C3 Spacer

2.2上游引物：

Primer-F-1：GTCAAGAAGGCGATAGAAGGCGATGCGCTG

Primer-F-2：CGATGCGCTGCGAATCGGGAGCGGCGATAC

Primer-F-3：CGATACCGTAAAGCACGAGGAAGCGGTCAG

2.3下游引物：

區(qū)域1：CATTTTCCACCATGATATTCGGCAAGCAGG

反向互補：Primer-R-1：CCTGCTTGCCGAATATCATGGTGGAAAATG

區(qū)域2：GGCATCGCCATGGGTCACGACGAGATCCTC

反向互補：Primer-R-2：GAGGATCTCGTCGTGACCCATGGCGATGCC

區(qū)域3：CACGACGAGATCCTCGCCGTCGGGCATGCG

反向互補：Primer-R-3：CGCATGCCCGACGGCGAGGATCTCGTCGTG

上下游引物Primer-F-1、Primer-F-2、Primer-F-3和Primer-R-1、Primer-R-2、Primer-R-3共有9種組合，可從中篩選出較優(yōu)引物對。

示例：

一條探針搭配不同引物的擴增效率對比（上下游引物各6條，36種組合）：

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