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布魯氏桿菌（Brucella）是一類革蘭氏陰性的致病菌，其菌體無鞭毛（不運(yùn)動(dòng)），部分菌株表面存在微莢膜結(jié)構(gòu)（光滑型菌株）。布魯氏桿菌具有細(xì)胞內(nèi)寄生特性，可在牛、羊、豬等多種家畜體內(nèi)長期存活。由布魯氏桿菌感染引起的布魯氏桿菌?。ê喎Q布病）是一種重要的人畜共患慢性傳染病，對(duì)畜牧業(yè)生產(chǎn)和人類健康構(gòu)成顯著威脅。在我國，牛、羊、豬是布病的主要?jiǎng)游飩魅驹?，其中羊型布魯氏桿菌對(duì)人體的傳播能力最強(qiáng)，致病性最為突出，造成的健康危害也最為嚴(yán)重。
近期，貴州省疾病預(yù)防控制中心在《ACS Publications》發(fā)表重磅研究成果。研究團(tuán)隊(duì)開發(fā)了一種結(jié)合多重交叉置換擴(kuò)增（MCDA）與CRISPR/Cas12b系統(tǒng)的新型檢測方法，用于快速、靈敏、特異地檢測綿羊布魯氏菌（Brucella ovis），為動(dòng)物疫病防控及公共衛(wèi)生安全提供了重要技術(shù)支撐。
一、研究背景與目標(biāo)問題
綿羊布魯氏菌病是一種重要的人畜共患病，主要引起公羊附睪炎，導(dǎo)致嚴(yán)重經(jīng)濟(jì)損失。傳統(tǒng)的細(xì)菌培養(yǎng)法耗時(shí)且不適合早期診斷，而常規(guī)PCR法需要復(fù)雜設(shè)備，限制了其在基層實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用。
目標(biāo)：開發(fā)一種無需復(fù)雜設(shè)備、快速、高靈敏度、高特異性的檢測方法，適用于現(xiàn)場和臨床診斷，以改善綿羊布魯氏菌病的防控。
二、核心技術(shù)
CRISPR/Cas12b-MCDA平臺(tái)原理：MCDA擴(kuò)增：在恒溫（65°C）下，使用10條特異性引物對(duì)綿羊布魯氏菌的特異性基因（BOV_A0500）進(jìn)行快速、高效的等溫?cái)U(kuò)增（45分鐘）。
CRISPR/Cas12b檢測：擴(kuò)增產(chǎn)物中含有PAM序列，可被Cas12b/gRNA復(fù)合物識(shí)別并激活Cas12b的“反式切割”活性，切割單鏈DNA（ssDNA）報(bào)告探針。
其中，使用了沃博生物(Warbio)相關(guān)產(chǎn)品,CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條,貨號(hào)JY0301，兼容性表現(xiàn)良好。
結(jié)果判讀：
可通過三種方式可視化結(jié)果
實(shí)時(shí)熒光分析：切割熒光探針釋放熒光信號(hào)。
紫外可視化：在紫外燈下觀察反應(yīng)液顏色變化（陽性呈亮綠色）。
側(cè)流層析生物傳感器（LFB）：使用試紙條讀取結(jié)果，陽性顯示兩條紅線（檢測線和控制線）。
平臺(tái)優(yōu)勢與流程
快速：從DNA提取到完成檢測，實(shí)時(shí)熒光法約需75分鐘，LFB法約需90分鐘。
設(shè)備簡單：LFB和紫外可視化法無需復(fù)雜儀器，僅需恒溫設(shè)備（如水浴鍋）。
防污染設(shè)計(jì)：在MCDA預(yù)擴(kuò)增系統(tǒng)中加入了尿嘧啶DNA糖基化酶（UDG）和dUTP，可有效消除高達(dá)10?¹² g/μL濃度的殘留污染，顯著降低假陽性風(fēng)險(xiǎn)。
三、性能評(píng)估
靈敏度:對(duì)純化基因組DNA的檢測限低至10 fg/μL，比實(shí)時(shí)濁度分析和MG比色法的靈敏度高10倍。對(duì)模擬綿羊全血樣本的檢測限為100 CFU/mL。
特異性：對(duì)28株菌株（包括9株布魯氏菌和19株非布魯氏菌）進(jìn)行測試，結(jié)果顯示100%特異性，僅綿羊布魯氏菌呈陽性，與其他布魯氏菌種及非布魯氏菌病原體無交叉反應(yīng)。
臨床樣本驗(yàn)證：對(duì)60份模擬綿羊全血樣本進(jìn)行檢測，與普通PCR相比，CRISPR/Cas12b-MCDA法顯示出100%的一致性、靈敏度和特異性，且靈敏度高于PCR。
四、結(jié)論與意義
本研究成功建立了一種基于CRISPR/Cas12b-MCDA的綿羊布魯氏菌檢測方法。該方法具有操作簡便、快速、超靈敏、高特異、防污染且無需復(fù)雜設(shè)備的特點(diǎn)，為基層實(shí)驗(yàn)室、現(xiàn)場及臨床環(huán)境提供了一種強(qiáng)大的診斷工具，對(duì)綿羊布魯氏菌病的早期發(fā)現(xiàn)、準(zhǔn)確診斷和有效防控具有重要的應(yīng)用價(jià)值。
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貨號(hào) |
產(chǎn)品 |
規(guī)格 |
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TABAS03KIT |
TwistAmp Basic Kit DNA擴(kuò)增試劑盒 |
96T |
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TAEXO02KIT |
TwistAmp exo 試劑盒 |
96T |
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B8201C1 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA基礎(chǔ)型） |
48T |
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B8202C3 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA熒光型） |
48T |
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B8203C5 |
DNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（DNA試紙條型） |
48T |
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B8204C7 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA基礎(chǔ)型） |
48T |
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B8205C9 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA熒光型） |
48T |
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B8206C0 |
RNA恒溫快速擴(kuò)增試劑盒（RNA試紙條型） |
48T |
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JY0209 |
雙靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型） |
50T |
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JY0201 |
單靶標(biāo)HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型） |
50T |
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JY0307 |
CRISPR單酶切及擴(kuò)增產(chǎn)物檢測試紙條 |
50T |
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JY0301 |
CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條 |
50T |
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JY0308 |
CRISPR雙酶切檢測試紙條（變色龍） |
50T |