基礎型項目引物篩選邏輯概述
• 收到合成引物后再無任何陽性測試前提下，進行全陰性測試，確定陰性條帶。
• 首先以質(zhì)粒高、中濃度為模板，例如可選用1pg/μL和10fg/μL進行引物初篩，篩選目的條帶特異明顯、條帶顏色亮、雜帶少且陰性正常（無非特異性條帶，引物二聚體少）的2-3對引物組合。
• 靈敏度實驗要求模板做3-4個濃度，各個濃度的擴增條帶呈現(xiàn)靈敏度變化，擴增條帶亮度有變化，最終呈現(xiàn)的結果圖要求最低濃度的檢測結果為陰性。最優(yōu)、次優(yōu)引物組合，一般質(zhì)粒靈敏度至少在1fg/μL。
• 將篩到的最優(yōu)、次優(yōu)引物探針進行實際樣本實驗，比較檢驗樣本的靈敏度，選出目前最優(yōu)的引物探針，一般假病毒的靈敏度是10³-10?copies/mL，根據(jù)不同項目靈敏度可能存在差異。
• 注意：凝膠電泳的結果圖最好標注maker大小，目的條帶大小
基礎型項目引物篩選邏輯實際案例
1、每個項目建議設計合成3-6條上下游引物用于后續(xù)篩選。若篩選引物未符合靈敏度要求，可嘗試在靶標的其他區(qū)域進行設計合成引物，再次篩選最終得到最優(yōu)引物組合。
2、本實驗案例在靶標上設計合成3條上游引物，3條下游引物，共9個引物組合進行示范。
Ø引物篩選1—全陰性驗證
• 9組引物組合進行全陰性測試，確定陰性正常。
• 在擴增子大小長度范圍無明顯條帶。
Ø引物篩選2（正篩）
• 隨機固定一條上游引物（此實驗選擇F1），與3條下游引物組合；
• 模板選擇高、中、低濃度測試，選擇條帶明顯、低濃度有擴增的引物組合；
• 引物組合F1+R1與F1+ R3相對較優(yōu)，R1/R3兩條下游引物表現(xiàn)較好；
Ø引物篩選4(靈敏度確認)
• 確定最優(yōu)引物組合F2+ R1后，進行初步靈敏度確認；
• 模板濃度的選擇：篩選引物時能檢出的最低濃度向上/向下選擇1-2個梯度；
• 最終確認環(huán)節(jié)建議加上陰性對照，確認陰性始終正常。
Ø結果討論
• 最優(yōu)引物組合F2/R1，
• 初步判定質(zhì)粒靈敏度0.1fg/uL。
下一步：
1、客戶可根據(jù)自身項目需求進行引物加入量優(yōu)化、反應時間優(yōu)化等來提供靈敏度；
2、特異性交叉驗證實驗；
3、收集實際樣本測試；
4、與市面上的PCR試劑進行靈敏度對比。
相關產(chǎn)品：
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貨號 |
產(chǎn)品 |
規(guī)格 |
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TABAS03KIT |
TwistAmp Basic Kit DNA擴增試劑盒 |
96T |
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TAEXO02KIT |
TwistAmp exo 試劑盒 |
96T |
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B8201C1 |
DNA恒溫快速擴增試劑盒（DNA基礎型） |
48T |
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B8202C3 |
DNA恒溫快速擴增試劑盒（DNA熒光型） |
48T |
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B8203C5 |
DNA恒溫快速擴增試劑盒（DNA試紙條型） |
48T |
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B8204C7 |
RNA恒溫快速擴增試劑盒（RNA基礎型） |
48T |
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B8205C9 |
RNA恒溫快速擴增試劑盒（RNA熒光型） |
48T |
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B8206C0 |
RNA恒溫快速擴增試劑盒（RNA試紙條型） |
48T |
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JY0209 |
雙靶標HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型） |
50T |
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JY0201 |
單靶標HybriDetect側(cè)向?qū)游鲈嚰垪l（彩虹型） |
50T |
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JY0307 |
CRISPR單酶切及擴增產(chǎn)物檢測試紙條 |
50T |
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JY0301 |
CRISPR Cas12/13 HybriDetect試紙條 |
50T |
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JY0308 |
CRISPR雙酶切檢測試紙條（變色龍） |
50T |
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貨號 |
包裝規(guī)格 |
中文名稱 |
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32108-01 |
100 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
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32108-03 |
1,000 pmoL |
LbCas12a (Cpf1) |
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32117-01 |
100 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
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32117-03 |
1,000 pmoL |
LwaCas13a (C2c2) |
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32118-01 |
100 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
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32118-03 |
1,000 pmoL |
AapCas12b (C2c1) |
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32119-01 |
100 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
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32119-03 |
1,000 pmoL |
Un1Cas12f1 (Cas14a1) |
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32104-01 |
100 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
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32104-03 |
1,000 pmoL |
AsCas12a (Cpf1) |
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32116-01 |
100 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
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32116-03 |
1,000 pmoL |
AacCas12b (C2c1) |
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32106-01 |
100 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
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32106-03 |
1,000 pmoL |
FnCas12a (Cpf1) |
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32110-01 |
100 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
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32110-03 |
1,000 pmoL |
Lb5Cas12a (Cpf1) |
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32101-01 |
100 pmoL |
SpCas9 |
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32101-03 |
1,000 pmoL |
SpCas9 |
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32102-01 |
100 pmoL |
Sp-dCas9 |
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32102-03 |
1,000 pmoL |
Sp-dCas9 |
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32120-01 |
100 pmoL |
Sp-nCas9（H840A） |
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32120-03 |
1,000 pmoL |
Sp-nCas9（H840A） |